Use of interplasmid recombination to generate stable selectable markers for yeast transformation: application to studies of actin gene control

Document Type

Article

Publication Date

1990

Publication Title

Genome

Volume

33

Issue

5

First Page

696

Last Page

706

Abstract

A plasmid recombination system has been developed that relies upon interplasmid exchanges for yeast cell viability. Two types of plasmids, one carrying the LEU2 allele inserted within yeast actin gene sequences and the other carrying 2-μm plasmid DNA and an intact actin gene, were constructed. Neither plasmid alone yielded transformants in the haploid Leu− strain AH22, but when cotransformed, a number of colonies were obtained. Southern blot analysis revealed that transformants arose because of recombination events within the homologous actin sequences that transferred the LEU2 gene to the actin gene on the 2-μm plasmid. The recombinant plasmids could be recovered, and sequence analysis of one recombination site revealed that the exchange event was faithful at the nucleotide level. The resulting recombinant plasmids carried a defective actin gene and presumably arose because of a double-crossover event. Deletion mutations that prevented actin gene expression on one donor plasmid enabled the recovery at a ..., Un système de recombinaisons de plasmides a été développé, qui s'appuie sur les échanges entre plasmides pour assurer la viabilité cellulaire des levures. Deux types de plasmides, l'un porteur de l'allèle LEU2 inséré à l'intérieur des séquences du gène de l'actine des levures, l'autre porteur d'un ADN plasmidique de 2 μm, et un gène intact de l'actine ont été produits. Employés seuls, ni l'un ni l'autre n'a pu produire de transformant chez la souche haploïde Leu− AH22, mais une fois cotransformés, un certain nombre de colonies ont été obtenues. Des analyses de buvardage Southern ont révélé que les transformations sont survenues, suite à des événements de recombinaison à l'intérieur des séquences homologues de l'actine qui ont transféré le gène LEU2 au gène de l'actine sur le plastide de 2 μm. Les plastides recombinants ont pu être recouvrés et l'analyse des séquences d'un site de recombinaison a révélé que les événements reliés aux échanges avaient lieu véritablement au niveau des nucléotides. Les plastid...

DOI

10.1139/g90-105

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